2020.11.16
糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。長期以來，糖尿病的主要診斷依據(jù)是空腹血糖和口服葡萄糖耐量試驗，現(xiàn)在這種狀況已經(jīng)改變。
2010年，美國糖尿病協(xié)會（ADA）糖尿病診療指南正式確定將HbA1c作為糖尿病診斷的一種指標(biāo)，診斷臨界值為≥6.5%；5.7%-6.4%歸類為“糖尿病高危人群”。2011年，世界衛(wèi)生組織（WHO）也建議在條件具備的國家和地區(qū)采用這一切點(diǎn)診斷糖尿病。目前，部分國家已將HbA1c作為篩查糖尿病高危人群和診斷糖尿病的重要指標(biāo)。
什么是糖化血紅蛋白？
糖化血紅蛋白（HbA1c）是人體血液中葡萄糖與血紅蛋白分子β鏈的N-末端纈氨酸殘基以共價鍵結(jié)合的穩(wěn)定化合物，全稱為血紅蛋白β鏈（血液）-N-（1-脫氧果糖-1-基）血紅蛋白β鏈。糖基化過程只依賴于時間、葡萄糖濃度和血紅蛋白水平。
與葡萄糖只能在一個時間點(diǎn)顯示血糖水平不同，HbA1c可以反映過去8-12周的血糖水平，且HbA1c測試不需要禁食，其水平也不會受到壓力、運(yùn)動和吸煙的嚴(yán)重影響。由于其穩(wěn)定性好，監(jiān)測頻率低，使得HbA1c成為國際公認(rèn)的用于評估糖尿病患者長期血糖狀況的理想指標(biāo)。
糖化血紅蛋白常見檢測方法
目前市場上有數(shù)十種HbA1c檢測方法，但是它們基本都是基于兩種檢測原理，即基于糖化和非糖化血紅蛋白所帶電荷不同進(jìn)行分離，和基于糖化和非糖化血紅蛋白結(jié)構(gòu)不同進(jìn)行分離。前一種原理用于離子交換色譜和電泳分析法，而后一種原理用于免疫分析、基于硼酸親和層析的分析和酶法。
不同的方法原理各有優(yōu)缺點(diǎn)，方法的選擇將取決于臨床和分析因素。通常情況下，變異血紅蛋白及衍生血紅蛋白主要干擾基于糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同的離子交換色譜法，包括離子交換高效液相色譜（HPLC）法。
不同HbA1c檢測方法對比表
|
方法 |
原理 |
優(yōu)勢 |
缺點(diǎn) |
|
酶法 |
使用位點(diǎn)特異的蛋白內(nèi)切酶和糖化氨基酸氧化酶，檢測反應(yīng)吸光度 |
反應(yīng)系統(tǒng)快速均一，儀器構(gòu)造簡單成本低 |
不能發(fā)現(xiàn)變異血紅蛋白，原理存在局限性，適用血紅蛋白濃度范圍有限，應(yīng)用較少 |
|
免疫法 |
血紅蛋白糖基末端的4個氨基酸作為單克隆抗體識別位點(diǎn) |
操作簡便、快速，避免大部分異常血紅蛋白的干擾 |
不能識別異常血紅蛋白，CV高于離子交換法 |
|
親和層析法 |
硼酸基團(tuán)與糖化的血紅蛋白可逆結(jié)合 |
受變異血紅蛋白干擾小，研究中用作參比方法 |
不能發(fā)現(xiàn)變異血紅蛋白，檢測總糖化血紅蛋白，HbA1c結(jié)果為計算值 |
|
POCT |
親和層析色譜、免疫法 |
高度自動化、簡便、耗時短、無需實驗室設(shè)備 |
精密度等性能指標(biāo)不符合臨床要求，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)不建議采用 |
|
毛細(xì)管電泳法 |
血紅蛋白各組分帶電荷不同 |
精密度高、敏感性高，受異常血紅蛋白干擾程度低 |
設(shè)備成本高、檢測速度等性能指標(biāo)有待提高 |
|
離子交換-HPLC |
血紅蛋白各組分帶電荷不同，通過陽離子交換樹脂分離 |
操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確、快速，技術(shù)成熟，應(yīng)用最廣泛 |
受到異常血紅蛋白和血紅蛋白病的干擾 |
|
HPLC-MS |
血紅蛋白β鏈酶切純化，定量檢測 |
高特異性、高靈敏度，作為HbA1c檢測的參考方法 |
耗時長、成本高、不適用于常規(guī)檢測 |
?
質(zhì)譜糖化血紅蛋白檢測新方法
（1）MALDI-TOF MS工作原理
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無論是在理論上還是在設(shè)計上都是十分簡單和高效的。它的工作原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，從而使生物分子電離，離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測，即通過測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來檢測離子。MALDI-TOF MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測試手段，并正扮演著越來越重要的作用。
MALDI-TOF MS工作原理示意圖
（2）MALDI-TOF MS檢測HbA1c原理
血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)
血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧的特殊蛋白質(zhì)，是使血液呈紅色的蛋白，由珠蛋白和血紅素組成，其珠蛋白部分是由兩對不同的珠蛋白鏈（α鏈和β鏈）組成的四聚體。
與其他HbA1c檢測系統(tǒng)不同，MALDI-TOF MS檢測的是游離的珠蛋白鏈，而不是四聚體。其檢測原理是體內(nèi)非酶促糖化反應(yīng)造成β珠蛋白鏈增加一個葡萄糖，使得糖化與非糖化β珠蛋白鏈分子量相差162Da，通過糖化β珠蛋白鏈/（β珠蛋白鏈+糖化β珠蛋白鏈）來計算其糖基化率。
糖化血紅蛋白的MALDI-TOF MS譜圖
（3）MALDI-TOF MS檢測HbA1c優(yōu)點(diǎn)
融智生物推出的QuanGHb糖化血紅蛋白定量質(zhì)譜系統(tǒng)，基于QuanTOF新一代寬譜定量飛行時間質(zhì)譜（新一代的MALDI-TOF MS）平臺，得益于其強(qiáng)大的分辨能力，能準(zhǔn)確定量糖化血紅蛋白（HbA1c）的同時，也可檢測其他類型變異血紅蛋白（hemoglobin variant），且抗干擾能力優(yōu)異。
可定量：糖化血紅蛋白定量檢測，同時可檢測變異血紅蛋白（hemoglobin variant）
效率高：一次可達(dá)96、384等通量；一個樣本30秒內(nèi)即可完成檢測
結(jié)果準(zhǔn)：質(zhì)譜準(zhǔn)確檢測，抗干擾能力強(qiáng)
成本低：測試成本低
（4）檢測流程
【參考文獻(xiàn)】
1.“Evaluation of MALDI-TOF MS for the measurement of glycated hemoglobin”, Clinica Chimica Acta 498 (2019) 154–160.?
2.“Detection of a novel hemoglobin variant Hb Liaoning by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”,? March 2019, Clin. Chem. Lab. Med.
3.“Potential of MALDI-TOF mass spectrometry to overcome the interference of hemoglobin variants on HbA1c measurement”, doi.org/10.1515/cclm-2020-0724.
